Con questo numero di SIF notizie desideriamo iniziare una nuova rubrica che abbiamo senza fantasia intitolato "Racconti dei borsisti".

Le ragioni di questa rubrica sono ovvie:

1) Far sapere a tutti i soci come sono stati spesi i soldi delle borse di perfezionamento assegnate dalla SIF nel semestre o nell'anno precedente.
2) Dare a  chi ha usufruito di questi contributi la possibilità di raccontare in modo sintetico, ma libero, la sua esperienza scientifica e umana all'estero

Ci auguriamo così che queste "relazioni" non siano solo momento di rendiconto (comunque importante), ma possano documentare la vivacità scientifica dei giovani farmacologi.

Nel nostro laboratorio presso l'Istituto di Scienze Farmacologiche di Milano abbiamo identificato un nuovo recettore P2Y per ATP, la cui attivazione porta ad astrogliosi reattiva. Segni di gliosi reattiva sono presenti in patologie neurologiche di tipo acuto (trauma, ictus, ischemia) e cronico (Alzheimer, Parkinson). Nell'ambito del programma del Dottorato di Ricerca in Tossicologia dell'Ambiente e dell'Alimentazione, (coordinatore: Prof. Flaminio Cattabeni), avevo in precedenza dimostrato che analoghi dell'ATP quali abmeATP, sono in grado, mediante questo nuovo recettore P2Y, di mimare in vitro il fenomeno della gliosi reattiva e di indurre, parallelamente, un aumento della sintesi della proteina ciclo-ossigenasi-2 (COX-2), enzima recentemente coinvolto nell'eziopatogenesi delle malattie sopra menzionate. Nel laboratorio del Prof. Joseph Neary ho approfondito i meccanismi alla base dell'induzione di COX-2 da parte di ATP. Mediante RT-PCR semiquantitativa, ho dimostrato che l'espressione genica di COX-2 è sensibilmente incrementata dopo trattamento con abmeATP e sembrerebbe dipendente dall'attivazione di MAP kinasi. Tramite "electrophoretic mobility shift assay" ho inoltre dimostrato che a,bmeATP determina un incremento del legame per il complesso AP-1, che potrebbe indurre la trascrizione diCOX-2 legandosi alla sequenza consenso presente sul promotore del gene. In conclusione, questo studio suggerisce la possibilità di un nuovo approccio farmacologico alla terapia delle patologie neurodegenerative a componente infiammatoria, vale a dire l'utilizzo di antagonisti selettivi per i recettori P2Y in grado di modulare l'espressione dell'enzima COX-2. I risultati di queste ricerche saranno oggetto di almeno due pubblicazioni in extenso su riviste internazionali con impact factor.

Anche grazie al contributo di una borsa per l'estero SIF, è da più di un anno che lavoro nel laboratorio del Prof. R.W. Tsien presso la Stanford University, occupandomi del filtro di selettività dei canali del calcio voltaggio dipendenti (VDCC), una regione funzionalmente importante perchè coinvolta nel determinare la selettività ionica del canale, bersaglio di agenti tossici e, probabilmente, collocata sulla via di accesso di farmaci di largo impiego quali le diidropiridine. Studi precedenti hanno dimostrato che quattro glutammati presenti in tale regione sono responsabili della selettività dei VDCC di tipo L. Il recente cloning dei canali T, una famiglia di VDCC con proprietà di permeazione diverse da quelle dei canali L, ha dimostrato che il filtro di selettività di questi canali presenta due glutammati e due aspartati invece di quattro glutammati. Di qui l'idea di stabilire l'effettivo ruolo dei glutammati del filtro di selettività nella permeazione ionica mediante l'analisi del comportamento di mutanti dei canali T, con filtro di selettività simile a quello dei canali L e viceversa. I risultati ottenuti ci hanno permesso di riconoscere che, per quanto specifici residui del filtro di selettività giochino uno specifico ruolo nella permeazione, i classici quattro glutammati non possono da soli spiegare la totalità del fenomeno. Grazie all'interazione con un gruppo di rilevanza mondiale, il mio soggiorno all'estero è risultato di estrema utilità perchè mi ha permesso di crescere notevolmente nel campo della farmacologia dei VDCC del quale mi occupo da diversi anni sotto la guida del Prof. Annunziato.
Grazie ancora alla SIF

Numerosi sono i dati che confermano il coinvolgimento dell'endotelina-1 (ET-1) nell'asma bronchiale.
Scopo del mio lavoro (presso il Department of Pharmacology, del King's College di Londra, nei laboratori diretti dal Prof. Clive P. Page) è stato la valutazione,del possibile ruolo svolto dall’ET-1 nella iperreattivita` delle vie aeree nel coniglio ed una sua eventuale partecipazione ai processi infiammatori a livello polmonare. Sono stati utilizzati conigli New Zeland White (NZW) di entrambi i sessi, del peso di 2,5-4,5 kg, di tre mesi di eta`. I conigli in neuroleptoanalgesia sono stati preparati per testare la funzione polmonare (resistenze polmonari, compliance dinamica, flusso, pressione transpolmonare). Gli animali sono stati intubati con un tubo endotracheale di 3,0 mm per la registrazione del flusso. La pressione pleurica è stata valutata mediante un catetere posto nel terzo inferiore dell'esofago con all'estremità un palloncino di latex. Le resistenze polmonari totali e la compliance sono state calcolate tramite un sistema computerizzato (Pulmonary Monitoring System). I risultati di questo studio suggeriscono che l’ET-1 è in grado di indurre iperresponsività delle vie aeree all’inalazione di istamina senza il coinvolgimento di cellule infiammatorie a livello polmonare come dimostrato dai risultati ottenuti dal lavaggio broncoalveolare, ma probabilmente mediante l’attivazione di fibre C capsaicina sensibili. Inoltre mediante l’uso di agonisti ed antagonisti selettivi per i sottotipi recettoriali dell’endotelina sembra che l’attivazione dei recettori ETA, sia in grado di mediare tale fenomeno. Tali dati sono stati frutto di due pubblicazioni su riviste internazionali: Naunyn - Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 5: 561-566, 1998.; In press 1999 e di diverse comunicazioni a congressi

All’inizio del 1996 ho usufruito di una borsa di studio di circa tre milioni di lire intesa a coprire parte delle mie spese di spostamento negli Stati Uniti per iniziare la mia attività di ricerca presso il National Institute of Neurological Disorders and Stroke, al National Institutes of Health in Bethesda, Maryland USA. Nonostante la natura stessa del finanziamento non fosse intesa a promuovere specifiche attività scientifiche, usufruire di tal tipo di supporto mi ha aiutato a iniziare una proficua attività scientifica che si protrae tutt’oggi. Mi preme sottolineare, in questa mia relazione, l’importanza di questi piccoli supporti finanziari che sono di grande giovamento per gli studiosi volontari italiani che intendono spendere periodi di differente durata all’estero per ulteriore perfezionamento. Le spese di spostamento rappresentano, talvolta un ostacolo, per coloro che non dispongono di adeguato ed indipendente supporto economico.
Con la presente, inoltre, voglio formalmente ringraziare la Società Italiana di Farmacologia per questo piccolo ma al tempo stesso determinante supporto.

Il progetto di ricerca di cui mi sto attualmente occupando all’Università di Chicago si basa sullo studio del metabolismo in vitro di farmaci antitumorali. In particolare, viene studiata la glucuronazione di agenti chemioterapici nei loro corrispettivi metaboliti inattivi glicuronati. Mediante l’uso di microsomi epatici umani e microsomi derivanti da sistemi eterologhi esprimenti specifiche isoforme enzimatiche, sono state identificate le isoforme responsabili della glucuronazione dei farmaci oggetto della ricerca. Ciò getta le basi scientifiche per la valutazione del ruolo del polimorfismo degli enzimi glucuroniltrasferasici nella chemioterapia antitumorale. La variabilità interindividuale in vitro dell’attività enzimatica in relazione alla produzione dei metaboliti glicuronati è risultata significativa, facendo ipotizzare la presenza di un polimorfismo genetico. Sono stati condotti inoltre studi di correlazione dell’attività enzimatica con specifici substrati per le isoforme glucuroniltrasferasiche responsabili della glucuronazione dei farmaci in studio. Le future ricerche saranno basate sulla identificazione del genotipo glucuroniltrasferasico mediante tecnica PCR effettuata su campioni di fegato umano e sullo studio della relazione esistente tra l’attività enzimatica in vitro e il genotipo ad essa associato. Per i farmaci antitumorali oggetto di studio, la glucuronazione rappresenta la maggiore via di detossificazione, e lo scopo ultimo della presente ricerca è quello di valutare il ruolo di polimorfismi enzimatici su base genetica nella farmacocinetica e farmacodinamica di agenti antitumorali. Gli esempi di farmaci come il 5-fluorourcile, la 6-mercaptopurina, l’amonafide e l’irinotecano suggeriscono che la caratterizzazione delle basi farmacogenetiche del metabolismo di farmaci con basso indice terapeutico può aprire la strada verso l’individualizzazione della dose da somministrare e l’ottimizzazione della terapia.

Grazie ad una Borsa di Ricerca assegnatami dalla SIF nel 1998, ho trascorso 4 mesi presso il Clinical Brain Disorder Branch, la sezione dell'NIH, diretta dal Dr. D.R. Weinberger a Bethesda, per condurre esperimenti mirati a valutare il coinvolgimento dei fattori neurotrofici nella schizofrenia, progetto che discuterò al termine del Corso di Dottorato. I risultati ottenuti presso l'Istituto di Scienze Farmacologiche di Milano avevano dimostrato come, nei ratti, l'espressione di alcuni fattori neurotrofici venisse modulata dai farmaci antipsicotici. Pertanto era di notevole interesse studiare se tali fattori fossero alterati anche in un modello animale di schizofrenia. La nostra attenzione si è focalizzata verso quei modelli sviluppati in base all'ipotesi del "neurosviluppo", che suggerisce che alterazioni del normale programma di sviluppo del sistema nervoso centrale possono concorrere all'insorgenza della schizofrenia. In particolare il modello animale ottenuto dai Dr. Lipska e Weinberger lesionando l'ippocampo ventrale di ratti al 7° giorno di vita postnatale mediante acido ibotenico, era quello più indicato per i nostri studi. Dopo la pubertà tali animali presentano anomalie comportamentali simili a quelle riscontrabili nella schizofrenia. Durante questo stage ho appreso diverse metodologie (la tecnica adottata per lesionare gli animali e per valutarne la corretta esecuzione), ho condotto una serie di esperimenti i cui risultati, presentati ad alcuni congressi, costituiranno la base di prossime pubblicazioni. Inoltre lo stage mi ha permesso di confrontarmi con una realtà ricca di stimoli, nonchè di instaurare collaborazioni che mi consentiranno di ritornare dal gennaio 2000 nello stesso laboratorio per un periodo almeno biennale.

Il progetto di ricerca è stato condotto presso il laboratorio di “Pharmacologie et Physicochimie des Interactions cellulaires et Moleculaires, Université Louis Pasteur et CNRS, Faculté de Pharmacie”, Strasburgo, Francia. Lo studio ha riguardato le modificazioni della reattività vascolare e dei meccanismi che sottendono tali disfunzioni vascolari in condizioni infiammatorie generalizzate, come quelle da shock settico. In particolare, lo studio ha avuto lo scopo di valutare il coinvolgimento della poli-ADP-ribosio-polimerasi (PARP) nella iporeattività vascolare in uno stato di shock settico, indotto in animali geneticamente modificati (PARP knockout) e nei rispettivi wild-type ed in che modo il fenotipo PARP knockout possa influenzare la produzione di ossido nitrico (NO) in risposta ad immunostimolazione con LPS, dal momento che recenti studi hanno indicato la partecipazione di questo enzima nelle risposte infiammatorie, evidenziando come, a concentrazioni molto elevate di perossinitriti, il meccanismo citotossico PARP-mediato diventi predominante. I risultati del mio studio hanno messo in evidenza come utilizzando inibitori specifici della iNOS e della guanilato ciclasi, solo nel ceppo selvatico l'NO, iperprodotto dalla iNOS, sembra contribuire alla regolazione del tono vascolare di anelli di aorta dopo trattamento con LPS. Gli esperimenti di contrazione sono stati poi confermati dai risultati del western blotting che hanno evidenziato la presenza della iNOS negli animali wild-type e la completa assenza nel ceppo mutante Tali dati indicano, quindi, come l’assenza dell’enzima PARP possa essere responsabile di una certa resistenza allo shock endotossico e come l’inibizione farmacologica di tale enzima possa essere vista come una possibile strategia terapeutica in corso di shock settico. Questa esperienza ha portato i suoi vantaggi anche in termini di pubblicazioni, in quanto i dati sopraesposti sono già stati inseriti in un lavoro pubblicato su EMBO Journal dal titolo: “Resistance to endotoxic shock as a consequence of defective NF-kB activation in poly (ADP-ribose) polymerase-1 deficient mice” EMBO J Vol.18 No.16 pp.4446-4454, 1999.

Lo studio da me condotto nei precedenti anni di ricerca dimostrava la presenza, nel cervello di ratto, di un difetto di attivazione età-correlato della protein chinasi C (PKC) ed il coinvolgimento di proteine di ancoraggio in questo deficit funzionale. Inoltre, alterazioni del sistema chinasico C e delle proteine di ancoraggio ad esso associate erano state dimostrate nel cervello di pazienti con malattia di Alzheimer. Considerando l’importanza giocata dal calcio quale fattore chiave di regolazione dell’attivazione della chinasi C, diventava interessante poter studiare, in modelli cellulari che esprimessero proteine coinvolte nella patologia di Alzheimer, i movimenti del calcio in risposta a stimoli farmacologici.
Il periodo di ricerca trascorso presso l’Università di Georgetown sotto la guida del Dr. Renè Etcheberrigaray, usufruendo della borsa SIF, mi ha consentito di imparare ed applicare la tecnica di imaging del calcio in un appropriato modello cellulare di studio della malattia di Alzheimer. Tale tecnica apre sbocchi per indagini sperimentali future volte a saggiare, in tempo reale, i movimenti del calcio in modelli in vitro in grado di mimare eventi biochimici associati per esempio a specifiche patologie o ad alterazioni del sistema di neurotrasmissione.
Frutto di questa collaborazione scientifica sono stati un articolo riguardante lo studio a cui si faceva riferimento in precedenza ("Enhanced BK induced calcium responsiveness in PC12 cells expressing the C-100 fragment of the amyloid precursor protein " - A. Pascale, S.Bhagavan, T.J. Nelson, R.L. Neve, D.L. McPhie and R. Etcheberrigaray - Molecular Brain Research 72:205-213, 1999) ed una rassegna sul calcio ("Calcium alterations in Alzheimer’s disease pathophysiology, models and therapeutic opportunities" A.Pascale and R.Etcheberrigaray - Pharmacological Res. 39 (2): 81-88, 1999).

La sottoscritta Dott.ssa Rosanna Rinaldi, dottoranda di ricerca in “Metabolismo dei Farmaci e Farmacocinetica” (XI ciclo), vincitrice della borsa di studio SIF, si è recata a Stoccolma (Svezia) presso il Karolinska Institutet, Institute of Environmental Medicine, Div. Biochemical Toxicology, sotto la guida del Prof. Ralf Morgenstern per un periodo di formazione scientifica di mesi sei nell’anno 1998. Durante tale periodo prorogato per altri sei mesi, la Dott.ssa Rinaldi si è occupata di uno studio sull’attivazione del Glutatione-S-Transferase microsomale utilizzando tutte le principali tecniche biochimiche.
I risultati sono stati promettenti così da poter preparare un lavoro scientifico dal titolo “Reactivity of Cys-49 and its influence on the activation of Microsomal Glutathione Transferase 1”. In tale lavoro è stata descritta la caratterizzazione di proprietà chimiche del sulfidrile Cys-49 (pKa=7.3*0.07) concludendo che l’ambiente circondante il glutatione transferasi microsomale 1, abbassa il pKa di almeno un ordine di grandezza rispetto il sulfidrile libero della cisteina.
Lo studio stechiometrico ha mostrato che le tre subunità della proteina non funzionano indipendentemente. Lo studio con differenti chinoni (derivati del benzene) ha mostrato che l’attivazione della proteina avviene con composti più reattivi e con minore imgombro sterico. Tale attivazione può essere usata per scoprire reattivi intermedi durante il metabolismo di composti estranei ma certi intermedi possono passare inosservati. E' da chiarire se quesi ultimi sono veramente meno tossici.

Nel corso del terzo anno del dottorato di ricerca in Neuroscienze, mi sono recata presso l’MRC Centre for Brain Repair dell’Università di Cambridge nel laboratorio di biologia molecolare diretto dalla Professoressa Maria Grazia Spillantini che da anni si occupa di patologie neurodegenerative del Sistema Nervoso Centrale ed in particolare della Malattia di Alzheimer.
Importanti sono i suoi studi sul coinvolgimento e sulle alterazioni biochimiche della proteina tau in queste patologie.
Il principale progetto del quale mi sono occupata è stato lo studio di dieci famiglie affette da frontotemporal dementia. Sono stati sequenziati gli esoni 7, 9, 10, 11, 12 e 13 del gene di tau di individui malati e sani. In due soggetti gemelli monozigoti affetti da FTDP-17 è stata trovata una mutazione (da C a T) in posizione +16 nell’introne che segue l’esone 10. Ciò determina una modificazione nella struttura dello stem-loop nell’introne che segue l’esone dieci ed una conseguente alterazione nella produzione di tau con tre e quattro repeat. Questa alterazione è stata trovata nei due gemelli ma non nei soggetti di controllo, indicando che la mutazione segrega con la patologia. La determinazione del difetto genetico responsabile della malattia indica che un cambiamento nella produzione di isoforme di tau con tre o quattro repeats è perciò sufficiente a portare allo sviluppo di aggregati fibrillari della proteina tau nelle cellule nervose e gliali determinando la loro degenerazione e risultando in disordini caratterizzati da demenza.
Pubblicazioni
- Rizzini et al. Tau mutation in familial frontotemporal dementia. (In preparation)
- M.Tolnay, M. G. Spillantini, C. Rizzini, D. Eccles, J. Lowe, D. Ellison, Widespread tau pathology in frontotemporal dementia and Parkinsonism due to 5’-splice site mutation in the tau gene. (Submitted)

Ho avuto la possibilità, grazie ad una Borsa di Ricerca SIF, di trascorrere tre mesi (maggio-luglio 1998) presso i Laboratori di Gastroenterologia della Parke-Davis, MI, USA, diretti dal Dr. Antonio Guglietta.
Durante questo breve periodo ho appreso due tecniche per indurre la colite ulcerosa nell'animale (TNBS, acido trinitrobenzen sulfonico e DSS, destrano solfato sodico) e i metodi di studio dei parametri che evidenziano in modo significativo tale patologia (mieloperossidasi e interleuchina 1-b).
Ho quindi applicato queste metodiche allo studio del ruolo che il sistema tachichininergico centrale sembra possa avere nell'ambito di tale processo  infiammatorio gastrointestinale, utilizzando due tachichinine naturali della pelle di anfibio, la PG-SPI e la PG-KII, agonisti rispettivamente dei recettori NK1 e NK3. I dati ottenuti hanno messo in evidenza che il sistema tachichininergico centrale NK1 è coinvolto nello sviluppo dei processi infiammatori dell'intestino, mentre non ancora chiaro appare il ruolo del sistema NK3.
Tali risultati sono stati presentati al XXIX Congresso Nazionale della SIF (Firenze, giugno 1999) e al II Congresso Europeo di Farmacologia (Budapest, luglio 1999).

Il pomodoro, uno dei principali costituenti della dieta mediterranea, dato il suo alto contenuto in flavonoli rappresenta una delle maggiori fonti di introduzione di questi importanti antiossidanti nell’organismo umano.
Negli alimenti i flavonoli si trovano principalmente sotto forma di coniugati, ma il loro contenuto è generalmente espresso come agliconi. Quindi è importante approfondire la conoscenza del contenuto e del profilo dei flavonol-coniugati nel pomodoro, specie alla luce delle recenti osservazioni che hanno evidenziato come il grado ed il tipo di coniugazione dei flavonol-glicosidi siano fattori molto importanti ai fini del loro assorbimento a livello intestinale. I trattamenti industriali a cui i pomodori vengono sottoposti per ottenere prodotti come il succo, la passata, etc., producono certamente delle variazioni sia dal punto di vista qualitativo che quantitativo dei flavonol-glicosidi.
Lo studio intrapreso nei laboratori dell'”Institute of Food Research” di Norwich (UK) ha riguardato la determinazione del contenuto e del profilo dei flavonol-glicosidi nel pomodoro e nei suoi prodotti commerciali.
I risultati ottenuti indicano un discreto contenuto in flavonoli ed un profilo molto vario essendo 11 i composti di interesse purificati ed identificati mediante tecniche MS ed NMR.
I risultati di questo lavoro sono stati presentati al 5th Int. ESCOP Symposium (London, October 15-16, 1998) ed al IX Congresso Nazionale della Società Italiana di Farmacognosia (Modena 21-24 Ottobre, 1998). Le ricerche in questo settore stanno continuando presso il Dipartimento Farmaco-Biologico dell’Università di Messina, insieme ad altri studi volti a chiarire l’efficacia antiossidante “in vitro” ed “in vivo” di questi composti e la loro biodisponibilità.