La giornata di studio dedicata al peptide nocicettina/orfanina FQ che si è svolta presso il Parco Scientifico San Raffaele a Milano, ha riscosso notevole successo, indicando che l’interesse per questo peptide ed il suo recettore è elevato. Più di cento ricercatori provenienti sia dall’Università che dalle industrie farmaceutiche hanno partecipato attivamente a questo primo Simposio monotematico della Società Italiana di Farmacologia. Parte rilevante e particolarmente apprezzata dai partecipanti è stata la presentazione di 20 posters. La discussione nell’area poster è stata intensa e vivace e ha permesso, soprattutto ai più giovani, di interagire con tutti i ricercatori italiani che si occupano di questo interessante argomento.

La scoperta del recettore, omologo ai recettori oppioidi e per questo chiamato ORL-1 (opioid receptor like 1) è avvenuta nel 1994, mentre il suo ligando endogeno, il peptide nocicettina, è stato identificato un anno dopo. A tutt’oggi più di 400 lavori scientifici sono stati pubblicati su questo argomento.

Dopo il benvenuto da parte del Prof. Walter Fratta (in rappresentanza del Consiglio Direttivo SIF), il Prof. Domenico Regoli (U. di Ferrara) ed il Dr. Ennio Ongini (Schering-Plough, Milano) hanno aperto il convegno presentando la storia del recettore ORL-1 e del suo ligando, nocicettina, e sottolineando le forti aspettative da parte della comunità scientifica circa le potenzialità terapeutiche di questo nuovo sistema peptide/recettore. Ongini ha posto particolare attenzione al concetto di recettore orfano associato alla proteina G. Su questi recettori sono oggi in corso ricerche intense per scoprire nuovi target farmacologici. Il percorso che ha portato alla identificazione della nocicettina rappresenta il primo successo nel campo della reverse pharmacology.

 

L’ampio spettro d’azione della nocicettina è stato approfondito nel corso del Simposio dai diversi relatori. Il Prof. Severo Salvadori (U. di Ferrara) ha presentato la parte di chimica farmaceutica, dalla struttura della nocicettina al suo confronto con gli oppioidi endogeni. La nocicettina, come la dinorfina A, possiede amminoacidi carichi (lisina ed arginina) indispensabili per il riconoscimento del proprio recettore. Salvadori ha inoltre mostrato che NC(1-13)NH₂ è il frammento minimo responsabile dell’interazione con il recettore e della sua attivazione sia in vitro che in vivo. Manipolando chimicamente la porzione N terminale è stata ottenuta una molecola ([Phe¹Y(CH₂-NH)Gly²]NC(1-13)NH₂) con attività agonista parziale. Successive modifiche hanno poi portato all’identificazione di un antagonista puro, selettivo e competitivo per il recettore ORL-1, [Nphe¹]NC(1-13)NH₂. Il Dr. Girolamo Calò (U. di Ferrara) ha presentato i risultati ottenuti sia in vitro che in vivo utilizzando questo nuovo antagonista. [Nphe¹]NC(1-13)NH₂ si lega selettivamente al recettore ORL-1 umano ricombinante espresso nelle cellule ovariche di criceto, CHO, ed antagonizza competitivamente gli effetti inibitori della nocicettina sull’accumulo di AMP ciclico in queste cellule, con un valore di pA₂=6.0. Il peptide antagonizza anche gli effetti inibitori della nocicettina sulle contrazioni indotte elettricamente in tessuti di varie specie animali (topo, ratto e cavia), con valori di pA₂ compresi tra 6.0 e 6.4. [Nphe¹]NC(1-13)NH₂ somministrato a livello intracerebroventricolare (i.c.v.) nel topo, previene gli effetti iperalgesici e anti-oppioidi della nocicettina, mentre quando viene somministrato da solo, manifesta un’azione anti-nocicettiva dose-dipendente, non influenzata dal naloxone e potenzia gli effetti analgesici della morfina. Le proprietà antagoniste di [Nphe¹]NC(1-13)NH₂ nei confronti della nocicettina, sono state anche dimostrate in un modello di dolore neuropatico nel ratto, ottenuto mediante legatura del nervo sciatico (Dr. Laura Corradini, Schering-Plough, Milano). Alcuni lavori recenti descrivono altri antagonisti per il recettore ORL-1, come ad esempio J-113397 (sviluppato da Banyu Pharmaceutical, Giappone). La Dr. Raffaella Bigoni (U. di Ferrara) ha mostrato come questo composto (il primo antagonista ORL1 di natura non peptidica) si comporti in tessuti isolati in vitro da potente antagonista della nocicettina (pA₂ circa 8).

La nocicettina svolge un ruolo importante nella modulazione dei meccanismi che sono alla base del dolore a livello del midollo spinale. Il Dr. Gabriele Biella (CNR ed U. di Milano) ha mostrato che gli effetti della nocicettina sono più pronunciati quando registrati in neuroni ottenuti da ratti “neuropatici”, suggerendo un ruolo primario del peptide nel dolore cronico. In animali di controllo, l’attività spontanea dei neuroni nocicettivi risulta inalterata dopo l’applicazione iontoforetica di nocicettina (1 mM), mentre l’attività evocata da stimoli nocicettivi meccanici risulta inibita dalla nocicettina. In animali “neuropatici”, il peptide riduce in modo significativo sia l’attività spontanea che quella evocata ed entrambi gli effetti non sono influenzati dal naloxone. La Dr. Rosalia Bertorelli (Schering-Plough, Milano) ha presentato i dati ad oggi disponibili sui topi geneticamente modificati, in cui è stato eliminato il gene per il peptide o per il recettore. Entrambi i mutanti appaiono in buona salute, sono fertili e non sono state evidenziate anormalità anatomiche sia a livello centrale che periferico. Topi knockout per il peptide dimostrano una maggiore suscettibilità allo stress, come evidenziato da esperimenti in cui sono stati misurati i livelli di ansia e dolore. Al contrario, i topi knockout per il recettore, non presentano alterazioni nella percezione del dolore, sia acuto che cronico. Infatti, Gemma Molyneux (Schering-Plough, Milano) ha dimostrato che l’insorgenza e lo sviluppo del dolore neuropatico dopo stimolazione sia termica che meccanica è paragonabile negli animali knockout per il recettore in confronto al gruppo di animali normali. Inoltre le risposte per gli agonisti dei diversi sottotipi recettoriali oppioidi non sono modificate, sia in vitro (vas deferens stimolato elettricamente) che in vivo (test della piastra calda).

La nocicettina sembra anche essere coinvolta nei processi di assunzione e gratificazione delle sostanze d’abuso. Studi recenti hanno mostrato che la nocicettina modifica sia gli effetti dell’etanolo che della morfina quando valutati con il test della conditioned place preference nel ratto ed è in grado di ridurre il consumo di etanolo in ratti alcool-preferenti geneticamente selezionati. Il Dr. Roberto Ciccocioppo (U. di Camerino) ha dimostrato che la nocicettina inibisce in maniera dose-dipendente (100-2000 ng/rat, i.c.v.) l’assunzione di alcool, ottenuto mediante la pressione di una leva, in ratti preventivamente allenati per l’auto-somministrazione di una soluzione alcolica al 10%. Gli effetti centrali della nocicettina, possono dipendere dalla sua capacità di modulare il rilascio di vari neurotrasmettitori a livello di alcune aree cerebrali. Il Dr. Michele Morari (U. di Ferrara), ha dimostrato che la nocicettina, perfusa nella sostanza nera (1 e 10 mM), aumenta i livelli extracellulari di glutammato. Questo effetto è chiaramente inibito dall’antagonista recettoriale [Nphe¹]NC(1-13)NH₂, ma non dal naloxone. Inoltre la nocicettina, attraverso l’attivazione dei recettori ORL-1, riduce il rilascio di serotonina dai sinaptosomi corticali di ratto.

È stato anche evidenziato il ruolo che il peptide svolge a livello del sistema nervoso periferico, con particolare attenzione agli effetti inibitori della nocicettina sul riflesso di minzione nel ratto. Il Dr. Alessandro Lecci (Menarini, Firenze) ha mostrato che il peptide può produrre effetti inibitori o eccitatori, a seconda della via di somministrazione utilizzata e delle condizioni sperimentali. La nocicettina esplica anche la sua attività a livello del sistema cardiovascolare, inducendo effetti ipotensivi transitori e bradicardia nel topo, come mostrato del Dr. Paolo Madeddu (U. di Sassari). Questi effetti non sono bloccati dal naloxone, mentre, al contrario, non sono più presenti quando gli animali vengono trattati con [Nphe¹]NC(1-13)NH₂.

Nella seconda parte del convegno si è svolta una Tavola Rotonda in cui sono state approfonditamente discusse le prospettive terapeutiche dei ligandi per il recettore ORL-1. Uno dei temi sulla cui importanza c’è stato ampio consenso da parte dei partecipanti è stato il fatto che la recente identificazione di sostanze agoniste ed antagoniste di natura non peptidica per il recettore ORL-1 contribuiranno in maniera rilevante a chiarire l’utilità di composti nocicettina-simili per il trattamento di alcune patologie. La discussione più animata si è avuta per quanto riguarda le prospettive terapeutiche dei derivati della nocicettina nella modulazione del dolore. L’azione svolta dalla nocicettina nei modelli di dolore neuropatico, quando somministrata a livello spinale, appare chiara. Al contrario, quando il peptide viene iniettato a livello sopraspinale, produce iperalgesia oppure non ha alcun effetto, mentre inibisce marcatamente le azioni analgesiche della morfina. L’interazione con la morfina non è invece presente a livello spinale. Il ruolo che la nocicettina gioca a livello della modulazione del dolore rimane quindi controverso. Non a caso, c’è stata partecipazione attiva alla discussione da parte di vari ricercatori. Il tema centrale è se sia meglio sviluppare un agonista od un antagonista dei recettori ORL-1 come potenziale farmaco per il trattamento del dolore. Sembra invece più chiaro il coinvolgimento degli agonisti per il recettore ORL-1 nel trattamento di disturbi del sistema nervoso centrale, poiché la nocicettina possiede rilevanti effetti ansiolitici ed anti-stress. Anche l’utilizzo degli animali geneticamente manipolati avvalora questa tesi, visto che i knockout per la nocicettina mostrano una maggiore suscettibilità allo stress. Inoltre, recentemente un gruppo di ricercatori di Hoffmann-La Roche ha dimostrato che un agonista ORL-1 non peptidico è in grado di indurre effetti ansiolitici in vari test comportamentali nel ratto. Agonisti per il recettore ORL-1 potrebbero anche essere efficaci nella regolazione della gratificazione che si manifesta con le sostanze d’abuso. La nocicettina, come il naloxone ed il naltrexone, riesce ad antagonizzare le proprietà motivazionali dell’etanolo, ma al contrario degli antagonisti oppioidi è priva di per sé di proprietà motivazionali e previene lo stress indotto dal desiderio di assumere alcool. Queste evidenze permettono di ampliare ulteriormente il ruolo della nocicettina a livello del sistema nervoso centrale ed aprono un’altra possibilità sull’utilizzo di agonisti selettivi per il recettore ORL-1 per la terapia delle tossicodipendenze.

L’ultima parte della discussione è stata dedicata alla nomenclatura del neuropeptide e del suo recettore. Il Prof. Regoli ha proposto che il recettore ORL-1 venga considerato come il quarto membro della famiglia dei recettori oppioidi e di conseguenza denominato OP₄.

Rimangono ancora da chiarire molti aspetti per quanto riguarda il ruolo fisiopatologico della nocicettina, sia a livello centrale che periferico. Sicuramente questo Convegno non ha risposto a tutti i dubbi e perplessità, ma è stato un momento molto importante di incontro e confronto per tutti i ricercatori coinvolti in questi studi.

Una nota a parte meritano la qualità dei lavori presentati e l’atmosfera che si respirava. Le ricerche presentate erano di livello eccellente e l’attenzione prestata era elevata. Chi organizza convegni conclude sempre dicendo che “è stato interessante”. A costo di sembrare “celebrativi” ci sembra, in tutta onestà, che questo sia stato un eccellente meeting dal quale è emersa la qualità di alcune ricerche svolte dalla farmacologia italiana. Ciò è testimoniato dalla pubblicazione del Meeting Report da parte della rivista Trends in Pharmacological Sciences (maggio 2000) che accetta solo segnalazioni di rilevanza internazionale.

 

Rosalia Bertorelli

 Girolamo Calò

Ennio Ongini

Domenico Regoli